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RUNX2 stimulates osteoblast-driven osteoclastogenesis by RANKL presentation
(USC Thesis Other)
RUNX2 stimulates osteoblast-driven osteoclastogenesis by RANKL presentation
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I
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 S T I M U L A T E S S T I M U L A T E S S T I M U L A T E S S T I M U L A T E S O S T E O B L A S T - D R I V E N O S T E O B L A S T - D R I V E N O S T E O B L A S T - D R I V E N O S T E O B L A S T - D R I V E N
O S T E O C L A S T O G E N E S I S O S T E O C L A S T O G E N E S I S O S T E O C L A S T O G E N E S I S O S T E O C L A S T O G E N E S I S B Y B Y B Y B Y R A N K L R A N K L R A N K L R A N K L
P R E S E N T A T I O N P R E S E N T A T I O N P R E S E N T A T I O N P R E S E N T A T I O N
b y b y b y b y
J I A N J I A N J I A N J I A N X I O N G X I O N G X I O N G X I O N G
A T h e s i s P r e s e n t e d t o t h e
F A C U L T Y O F T H E U S C G R A D U A T E S C H O O L
U N I V E R S I T Y O F S O U T H E R N C A L I F O R N I A
I n P a r t i a l F u l f i l l m e n t o f t h e
R e q u i r e m e n t s f o r t h e D e g r e e
M A S T E R O F S C I E N C E
( B I O C H E M I S T R Y A N D M O L E C U L A R B I O L O G Y )
A u g u s t 2 0 1 3
C o p y r i g h t 2 0 1 3 J I A N X I O N G
I I
A C K N O WL E D G E M E N T A C K N O WL E D G E M E N T A C K N O WL E D G E M E N T A C K N O WL E D G E M E N T S S S S
I g r e a t l y t h a n k D r . B a r u c h F r e n k e l , a s m y m e n t o r , f o r g u i d i n g a n d
s u p p o r t i n g t h i s s t u d y . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y A n t h o n y M a r t i n .
T h a n k D r . A d i s e t i y o H . , D r . B a n i w a l S K . , D r . C h i m g e n O . , D r . K o r o m i l a T . ,
D r . L i t t l e G H . , a n d o t h e r f a c u l t y i n o u r l a b , s i n c e r e l y , f o r a l l t h e t e c h n i q u e
i n s t r u c t i o n s a n d h e l p .
S p e c i a l l y t h a n k D r . H i r o s h i S u z u k i a n d D r . E b r a h i m Z a n d i f o r t h e o f f e r o f
G F P - R A N K L a n d N F κ B - l u c i f e r a s e p l a s m i d s a s g i f t s .
I I I
L I S T L I S T L I S T L I S T O F O F O F O F C O N T E N T C O N T E N T C O N T E N T C O N T E N T S S S S
A C K N O WL E D G E M E N T S A C K N O WL E D G E M E N T S A C K N O WL E D G E M E N T S A C K N O WL E D G E M E N T S I I
L I S T L I S T L I S T L I S T O F O F O F O F T A B L E S T A B L E S T A B L E S T A B L E S
I V
L I S T L I S T L I S T L I S T O F O F O F O F F I G U R E S F I G U R E S F I G U R E S F I G U R E S
V
A B S T R A C T A B S T R A C T A B S T R A C T A B S T R A C T
V I
I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N
1
O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S
7
M A T E R I A L S M A T E R I A L S M A T E R I A L S M A T E R I A L S A N D A N D A N D A N D M E T H O D S M E T H O D S M E T H O D S M E T H O D S
8
M a t e r i a l s M a t e r i a l s M a t e r i a l s M a t e r i a l s
8
M e t h o d s M e t h o d s M e t h o d s M e t h o d s
8
A n i m a l a n d c e l l c u l t u r e
8
P l a s m i d c o n s t r u c t i o n a n d t r a n s f e c t i o n
9
W e s t e r n b l o t a n d a n a l y s i s
1 1
R N A e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s
1 1
C o - c u l t u r e a n d T R A P a s s a y
1 2
I m m u n o f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s
1 3
C o - c u l t u r e a n d l u c i f e r a s e a s s a y
1 3
S t a t i s t i c a l a n a l y s i s
1 4
I V
R E S U L T S R E S U L T S R E S U L T S R E S U L T S
1 5
E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t o f o f o f o f p r i m a r y p r i m a r y p r i m a r y p r i m a r y o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s ( P O B s ) ( P O B s ) ( P O B s ) ( P O B s )
c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2
d o x d o x d o x d o x
) ) ) )
1 5
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s t a r g e t t a r g e t t a r g e t t a r g e t g e n e g e n e g e n e g e n e
e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , b u t b u t b u t b u t n o t n o t n o t n o t R A N K L R A N K L R A N K L R A N K L
1 7
O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n o f o f o f o f R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 i n i n i n i n o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s
d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n o f o f o f o f c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s
1 8
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n o f o f o f o f
R A N K L R A N K L R A N K L R A N K L o n o n o n o n t h e t h e t h e t h e o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e
2 1
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n i n i n i n i n o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s N F N F N F N F κ κ κ κ B B B B
s i g n a l i n g s i g n a l i n g s i g n a l i n g s i g n a l i n g i n i n i n i n c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c c e l l s c e l l s c e l l s c e l l s
2 3
D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N
2 8
R E F E R E N C E S R E F E R E N C E S R E F E R E N C E S R E F E R E N C E S
3 4
V
L I S T L I S T L I S T L I S T O F O F O F O F T A B L E S T A B L E S T A B L E S T A B L E S
T a b l e 1 . R e a g e n t s u s e d i n t h i s s t u d y
1 0
T a b l e 2 . I n s t r u m e n t s u s e d i n t h i s s t u d y
1 1
T a b l e 3 . P r i m e r s e q u e n c e s u s e d i n q P C R a n a l y s i s
1 2
V I
L I S T L I S T L I S T L I S T O F O F O F O F F I G U R E S F I G U R E S F I G U R E S F I G U R E S
F i g 1 . T h e e s t a b l i s h m e n t o f P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s
1 6
F i g 2 . E x p r e s s i o n o f R U N X 2 t a r g e t g e n e s
1 8
F i g 3 . O s t e o c l a s t m a t u r a t i o n w a s s t i m u l a t e d b y R U N X 2
2 0
F i g 4 . G F P - R A N K L m e m b r a n e p r e s e n t a t i o n w a s i n c r e a s e d b y R U N X 2
2 4
F i g 5 . R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n i n P O B s i n c r e a s e s N F κ B a c t i v i t y i n c o -
c u l t u r e d o s t e o c l a s t i c c e l l s
2 7
V I I
A B S T R A C T A B S T R A C T A B S T R A C T A B S T R A C T
T h e m a m a l i a n s k e l e t o n i s c o n t i n u o u s l y r e m o d e l e d v i a t w o p r o c e s s e s : b o n e
f o r m a t i o n a n d b o n e r e s o r p t i o n . R U N X 2 , i n i t i a l l y r e c o g n i z e d a s a m a s t e r
r e g u l a t o r o f o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n , w a s l a t e r r e c e n t l y
a s s i g n e d a r o l e i n m e d i a t i n g o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s b u t t h e
u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s a r e p o o r l y d e f i n e d . T o i n v e s t i g a t e h o w e x p r e s s i o n
o f R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s c o n t r o l s o s t e o c l a s t o g e n e s i s , w e e s t a b l i s h e d a
p r i m a r y o s t e o b l a s t c u l t u r e s y s t e m t h a t e x p r e s s e s R U N X 2 i n r e s p o n s e t o
d o x y x y c l i n e . I n d u c t i o n o f R U N X 2 r e s u l t e d i n s t i m u l a t i o n o f i t s c l a s s i c a l
t a r g e t g e n e o s t e o c a l c i n , b u t n o t o f R A N K L m R N A . I n t e r e s t i n g l y , h o w e v e r ,
i n d u c t i o n o f R U N X 2 i n t h e p r i m a r y o s t e o b l a s t s r e s u l t e d i n i n c r e a s e d
p r e s e n t a t i o n o f R A N K L o n t h e c e l l m e m b r a n e a n d i n c r e a s e d N F k B a c t i v i t y
i n c o - c u l t u r e d o s t e o c l a s t i c c e l l s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t R U N X 2 - m e d i a t e d
o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s o c c u r s v i a m o d u l a t i o n o f R A N K L i n
o s t e o b l a s t s a t t h e p o s t - t r a n s l a t i o n a l l e v e l .
K E Y K E Y K E Y K E Y WO R D S : WO R D S : WO R D S : WO R D S : R U N X 2; R A N K L ; os t e oc l a s t oge ne s i s ; m ous e pr i m a r y os t e obl a s t s
1
I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N I N T R O D U C T I O N
B o n e s a r e r i g i d o r g a n s f u n c t i o n i n g t o s u p p o r t a n d p r o t e c t a v a r i e t y o f b o d y
o r g a n s [ 1 ] . D u r i n g t h e a d u l t h o o d p h a s e o f m a m m a l i a n l i f e , e v e n t h o u g h t h e
s k e l e t o n i s n o l o n g e r g r o w i n g , i t i s c o n t i n u o u s l y r e m o d e l e d b y c o u p l e d
a c t i v i t i e s o f b o n e r e s o r b i n g o s t e o c l a s t s a n d b o n e f o r m i n g o s t e o b l a s t s [ 2 ] .
T h e b a l a n c e b e t w e e n t h e s e t w o p r o c e s s e s i s t h e k e y t o t h e m a i n t e n a n c e o f
b o n e i n t e g r i t y , a n d i m b a l a n c e b e t w e e n t h e t w o r e s u l t s i n m e t a b o l i c b o n e
d i s e a s e , m o s t c o m m o n l y o s t e o p o r o s i s [ 3 ] .
R U N X 2 , p r e v i o u s l y a l s o k n o w n a s C f b a 1 , P e b p 2 α A 1 , o r A M L - 3 , i s o n e o f
t h r e e m e m b e r s o f t h e m a m m a l i a n R u n t - r e l a t e d f a m i l y [ 4 , 5 ] , w h i c h p l a y
p i v o t a l r o l e s i n e m b r y o g e n e s i s : R U N X 2 i s m a i n l y i m p o r t a n t f o r
o s t e o g e n e s i s , R U N X 1 f o r h e m a t o p o i e t i c d e v e l o p m e n t a n d R U N X 3 f o r
g a s t r o i n t e s t i n a l d e v e l o p m e n t a n d n e u r o g e n e s i s [ 5 ] . T h e t h r e e R U N X
p r o t e i n s h e t e r o d i m e r i z e w i t h a c o m m o n c o - a c t i v a t o r , C b f β , a n d t h e
c o m p l e x e s s u b s e q u e n t l y b i n d t o a n d r e g u l a t e t a r g e t g e n e t r a n s c r i p t i o n [ 6 ] .
W e l l - k n o w n a s a m a s t e r r e g u l a t o r o f b o n e f o r m a t i o n , R U N X 2 i s e x p r e s s e d
i n o s t e o b l a s t s , a s w e l l a s c h o n d r o c y t e s [ 7 ] . E x p r e s s i o n o f R U N X 2 i n
m e s e n c h y m a l p r o g e n i t o r c e l l s r e s u l t s i n t h e i r c o m m i t m e n t t o o s t e o b l a s t
d i f f e r e n t i a t i o n . C o m p l e t i o n o f t h i s p r o c e s s a l s o r e q u i r e s W n t s i g n a l i n g a n d
S P 7 , w h i c h i n h i b i t R U N X 2 - e x p r e s s i n g m e s e n c h y m a l c e l l s f r o m
2
d i f f e r e n t i a t i n g i n t o c h o n d r o c y t e s [ 6 ] . P e r h a p s t h e b e s t d e m o n s t r a t i o n o f t h e
r o l e o f R U N X 2 i n o s t e o g e n e s i s i s t h e a b s e n c e o f m i n e r a l i z e d b o n e s i n
R U N X 2 - k n o c k o u t m i c e [ 8 , 9 ] . T h e s e m i c e d e v e l o p t o t e r m b u t d i e s h o r t l y
a f t e r b i r t h d u e t o r e s p i r a t o r y d i s t r e s s [ 4 ] . R U N X 2 h e t e r o z y g o u s m i c e w e r e
a l s o o b s e r v e d w i t h l o w b o n e m a s s [ 1 0 ] . H a p l o i n s u f f i c i e n c y a n d / o r p a r t i a l
l o s s - o f - f u n c t i o n m u t a t i o n s o f R U N X 2 a r e l i n k e d t o a r a r e s k e l e t a l d i s o r d e r ,
c l e i d o c r a n i a l d y s p l a s i a ( C C D ) [ 1 1 ] . S o m e s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s
( S N P s ) i n R U N X 2 r e g u l a t o r y s e q u e n c e s a l s o r e s u l t i n C C D b y a l t e r i n g
b i n d i n g s i t e s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s e s s e n t i a l f o r R U N X 2 e x p r e s s i o n . [ 1 2 ] .
O n t h e o t h e r h a n d , R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n i n c h o n d r o c y t e s c a u s e s
e x c e s s i v e b o n e f o r m a t i o n a l o n g w i t h m u l t i p l e j o i n t f u s i o n s [ 1 3 ] .
R U N X 2 h a s b e e n i n i t i a l l y c o n s i d e r e d a t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o r . H o w e v e r , i t
i s i n c r e a s i n g l y a p p r e c i a t e d t h a t R U N X 2 f u n c t i o n s a s a t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t o r o r r e p r e s s o r i n a c o n t e x t - d e p e n d e n t m a n n e r [ 1 4 ] , a c h o i c e
f a c i l i t a t e d b y t h e r e c r u i t m e n t o f e i t h e r t r a n s c r i p t i o n a l c o - a c t i v a t o r s s u c h a s
C B P , p 3 0 0 , M O Z , a n d M O R F [ 1 5 ] o r t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r s , s u c h a s
T L E ( t r a n s d u c i n - l i k e e n h a n c e r o f s p l i t ) , m S i n 3 a , a n d Y A P ( y e s - a s s o c i a t e d
p r o t e i n s ) [ 4 ] . T h e s e c o - r e g u l a t o r s i n t e r a c t w i t h c o m p o n e n t s o f t h e b a s a l
t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y a s w e l l a s c h r o m a t i n m o d i f i e r s s u c h a s M O Z a n d
H D A C s ( h i s t o n e d e a c e t y l a s e s ) , w h i c h p r o m o t e e i t h e r c h r o m a t i n o p e n i n g o r
c o m p a c t i o n [ 4 , 1 5 ] .
3
W h e r e a s o s t e o b l a s t s a r e m e s e n c h y m a l c e l l s , o s t e o c l a s t s a r e h e m a t o p o i e t i c
c e l l s o f t h e m o n o c y t e l i n e a g e , a n d a r e r e l a t e d t o t i s s u e m a c r o p h a g e s .
O s t e o b l a s t s f o r a d u l t b o n e t u r n o v e r a r e m o s t l y s u p p l i e d f r o m b o n e m a r r o w
s t r o m a l a n d p e r i o s t e a l m e s e n c h y m a l p r o g e n i t o r c e l l s , a s w e l l a s p o s s i b l y
f r o m c i r c u l a t i n g p r o g e n i t o r s [ 1 ] . O s t e o c l a s t s t h a t r e s o r b a d u l t b o n e m a t e r i a l
o r i g i n a t e f r o m b o n e m a r r o w m o n o c y t i c c e l l s a n d p o s s i b l y f r o m o t h e r
h e m a t o p o i e t i c o r g a n s , s u c h a s t h e s p l e e n . D i f f e r e n t i a t i o n o f M o n o c y t i c c e l l s
i n t o o s t e o c l a s t s a n d t h e i r a c t i v a t i o n t o r e s o r b b o n e a r e c r i t i c a l l y d e p e n d e n t
o n s t i m u l a t i o n o f t h e m o n o c y t e / o s t e o c l a s t r e c e p t o r R A N K ( r e c e p t o r
a c t i v a t o r o f n u c l e a r f a c t o r - κ B ) , a m e m b e r o f t h e t u m o r n e c r o s i s f a c t o r
f a m i l y [ 1 ] . R A N K l i g a n d ( R A N K L ) , w h i c h b i n d s t o R A N K , i s p r i m a r i l y
e x p r e s s e d b y o s t e o b l a s t s , o t h e r b o n e l i n i n g c e l l s [ 1 6 ] a n d o s t e o c y t e s [ 1 7 , 1 8 ] .
F o r o s t e o c l a s t a c t i v a t i o n , R A N K L i s e i t h e r s e c r e t e d ( s o l u b l e R A N K L ,
s R A N K L ) o r p r e s e n t e d o n t h e o s t e o b l a s t s u r f a c e [ 1 ] . T h e m o s t e f f i c i e n t
o s t e c l a s t a c t i v a t i o n o c c u r s b y b i n d i n g o f R A N K L t o R A N K v i a c e l l - c e l l
i n t e r a c t i o n b e t w e e n o s t e o b l a s t s a n d o s t e o c l a s t p r e c u r s o r s , r e s u l t i n g i n
a c t i v a t i o n o f s p e c i f i c s i g n a l i n g p a t h w a y s , i n p a r t i c u l a r N F κ B , i n o s t e o c l a s t
p r e c u r s o r s [ 1 9 ] . I n s u f f i c i e n c y o f R A N K L r e s u l t s i n o s t e o c l a s t s d e f i c i e n c y
a n d o s t e o p e t r o s i s [ 1 6 ] .
A f t e r b e i n g s y n t h e s i z e d a n d m o d i f i e d i n t h e G o l g i a p p a r a t u s , R A N K L i s
t r a n s f e r r e d t o l y s o s o m e s m a i n l y f o r s t o r a g e , b u t a l s o t o t h e p l a s m a
m e m b r a n e i n a m i n o r p a t h w a y [ 2 0 ] . I n i t i a l l y , o n l y R A N K L p r e s e n t e d o n t h e
o s t e o b l a s t s s u r f a c e i n t e r a c t s w i t h R A N K o n o s t e o c l a s t s t h r o u g h d i r e c t c e l l -
4
c e l l i n t e r a c t i o n [ 2 1 ] . T h e i n d u c e d s R A N K L i n R U N X 2
- / -
m i c e f a i l e d t o
c o m p l e t e t h e f u n c t i o n a l a n d m o r p h o l o g i c a l d e v e l o p m e n t o f o s t e o c l a s t [ 2 2 ] .
T h u s , i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n w a s l i k e l y m i s s e d i n m a n y p r e v i o u s s t u d i e s t h a t
f o c u s e d o n m e a s u r i n g R A N K L m R N A o r t o t a l R A N K L p r o t e i n l e v e l s ,
w i t h o u t p a y i n g m u c h a t t e n t i o n t o m e a s u r e m e n t o f t h e a m o u n t s o f R A N K L
m o l e c u l e s p r e s e n t e d o n t h e o s t e o b l a s t m e m b r a n e . F u r t h e r m o r e , l i t t l e i s
k n o w n a b o u t m e c h a n i s m s t h a t r e g u l a t e R A N K L t r a f f i c k i n g a n d i t s
p r e s e n t a t i o n o n t h e o s t e o b l a s t m e m b r a n e .
B e c a u s e R U N X 2 k n o c k o u t m i c e f a i l e d t o m a k e b o n e t i s s u e [ 2 3 ] , a n d
b e c a u s e o s t e o b l a s t s e x p r e s s i n g d o m i n a n t - n e g a t i v e ( D N ) R U N X 2 w e r e
f u n c t i o n a l l y c o m p r o m i s e d , l e a d i n g t o o s t e o p e n i a i n v i v o [ 2 3 ] , i t w a s
u n e x p e c t e d t h a t t r a n s g e n i c m i c e o v e r - e x p r e s s i n g R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s
w e r e r e p o r t e d b y t w o d i f f e r e n t g r o u p s t o d e v e l o p o s t e o p e n i a a n d
s p o n t a n e o u s f r a c t u r e s [ 2 , 3 ] . T h e b o n e l o s s o b s e r v e d i n m i c e w i t h o s t e o b l a s t s
t h a t o v e r - e x p r e s s R U N X 2 w a s a t t r i b u t a b l e t o h i g h l e v e l s o f b o n e r e s o r p t i o n .
E v e n t h o u g h t h e s e m i c e h a d i n c r e a s e d n u m b e r s o f o s t e o b l a s t s , t h e s e
o s t e o b l a s t s w e r e n o t f u l l y f u n c t i o n a l , a n d c o u l d n o t o v e r c o m e t h e h i g h l e v e l
o f b o n e r e s o r p t i o n m e d i a t e d b y e x a g g e r a t e d o s t e o b l a s t - d r i v e n
o s t e o c l a s t o g e n e s i s . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e i n c r e a s e d o s t e o c l a s t o g e n e s i s
w a s m e d i a t e d b y s t i m u l a t i o n o f g e n e s s u c h a s M - C S F a n d R A N K L [ 3 ] .
H o w e v e r , R A N K L m R N A w a s i n c r e a s e d b y o n l y t w o f o l d , w h i c h i s n o t
q u i t e c o n s i s t e n t w i t h t h e m u c h g r e a t e r i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f o s t e o c l a s t s
i n v i v o a s w e l l a s t h e n u m b e r o f o s t e o c l a s t s t h a t d e v e l o p e d w h e n t h e
5
R U N X 2 - o v e r - e x p r e s s i n g o s t e o b l a s t s w e r e c o - c u l t u r e d w i t h w i l d - t y p e p r e -
o s t e o c l a s t s i n v i t r o [ 3 , 7 ] . T h e p r e m i s e o f m y t h e s i s i s t h a t t h e r e m u s t b e
s o m e o t h e r m e c h a n i s m b y w h i c h R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s a u g m e n t s t h e i r
o s t e o c l a s t o g e n i c p o t e n t i a l , p o s s i b l y b y i n c r e a s i n g t h e p o t e n c y o f R A N K L
p o s t - t r a n s l a t i o n a l l y .
C o - c u l t u r e e x p e r i m e n t s f u r t h e r i n d i c a t e d t h a t o s t e o b l a s t - d r i v e n
o s t e o c l a s t o g e n e s i s w a s e n h a n c e d w h e n t h e o s t e o b l a s t s o v e r e x p r e s s R U N X 2
[ 3 , 7 ] . I n t h e s e s t u d i e s , p r i m a r y o s t e o b l a s t s f r o m m u r i n e c a l v a r i a
o v e r e x p r e s s i n g R U N X 2 w e r e c o - c u l t u r e d w i t h e i t h e r s p l e e n c e l l s [ 3 ] o r b o n e
m a r r o w c e l l s [ 3 , 7 ] . A r e m a r k a b l e i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f T R A P - s t a i n e d
o s t e o c l a s t s w a s r e p o r t e d i n b o t h s t u d i e s w h e n t h e o s t e o b l a s t s o v e r - e x p r e s s e d
R U N X 2 . I n a m o r e r e c e n t s t u d y , a d o x - i n d u c i b l e R U N X 2 l e n t i v i r a l s y s t e m
w a s i n t r o d u c e d i n t o S T 2 b o n e m a r r o w - d e r i v e d p l u r i p o t e n t m e s e n c h y m a l
c e l l s . D o x - m e d i a t e d R U N X 2 i n d u c t i o n i n t h i s s y s t e m r e s u l t e d i n b o t h
o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d i n c r e a s e d c a p a b i l i t y o f t h e c e l l s t o d r i v e
o s t e o c l a s t o g e n e s i s w h e n c o - c u l t u r e d w i t h s p l e n o c y t e s a s a s o u r c e o f
m o n o c y t i c c e l l s [ 2 4 ] .
T h e s t u d i e s c i t e d a b o v e s u g g e s t t h a t R U N X 2 , w h i c h i s n e c e s s a r y f o r
o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n , m u s t b e t i g h t l y c o n t r o l l e d , a n d
t h a t e x p r e s s i o n l e v e l s h i g h e r t h a n a n o p t i m u m c a u s e s i n c r e a s e d
o s t e o c l a s t o g e n e s i s i n v i t r o a n d i n v i v o a n d o s t e o p o r o s i s i n v i v o . T h e r e i s
6
e v e n e v i d e n c e t h a t R U N X 2 a c t i v i t y i n n o r m a l m i c e i s i n f a c t h i g h e r t h a n t h e
i d e a l a c t i v i t y , w h i c h w o u l d y i e l d m a x i m u m b o n e m a s s . S p e c i f i c a l l y ,
i n h i b i t i o n o f R U N X 2 i n v i v o , t h r o u g h e x p r e s s i o n o f a R U N X 2 D N i n
o s t e o b l a s t s , r e s u l t e d i n d e c r e a s e d o s t e o c l a s t n u m b e r , d e c r e a s e d b o n e
r e s o r p t i o n a n d i n c r e a s e d b o n e m a s s [ 7 ] . I n t h e s a m e s t u d y , o s t e o b l a s t s w i t h
D N - R U N X 2 w e r e a l s o c o - c u l t u r e d w i t h s p l e e n c e l l s i n v i t r o . A s i g n i f i c a n t l y
r e d u c e d n u m b e r o f T R A P - p o s i t i v e o s t e o c l a s t s w a s d e t e c t e d a s c o m p a r e d t o
t h e n u m b e r o f o s t e o c l a s t s f o r m e d i n c o - c u l t u r e s w i t h o s t e o b l a s t s t h a t
e x p r e s s e d e n d o g e n o u s R U N X 2 a t n o r m a l l e v e l s [ 7 ] .
T h e l a c k o f o s t e o c l a s t d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f o s t e o b l a s t s l a c k i n g
R U N X 2 i s a t t r i b u t a b l e t o i m p a i r e d R A N K L t r a f f i c k i n g a n d / o r f a i l u r e o f
t h e s e o s t e o b l a s t s t o e x p r e s s o t h e r R U N X 2 t a r g e t g e n e s c o d i n g
o s t e o c l a s t o g e n i c s i g n a l s . I n d e e d , t h e R U N X 2 t r a n s c r i p t o m e i n S T 2 p r e -
o s t e o b l a s t s i n c l u d e s g e n e s w i t h e s t a b l i s h e d r o l e s i n o s t e o c l a s t d i f f e r e n t i a t i o n
s u c h a s o s t e o c l a s t o g e n i c s t i m u l a t o r s l i k e S e m a 7 a , L t c 4 s , e t c . a n d i n h i b i t o r s
s u c h a s O P G a n d S e m a 3 a [ 2 3 ] .
W h i l e i n v e s t i g a t i n g R U N X 2 - r e g u l a t e d g e n e n e t w o r k s i n p r o s t a t e c a n c e r
c e l l s , L i t t l e e t a l . h a s r e c e n t l y a s s i g n e d a n o v e l r o l e f o r R U N X 2 , i . e . ,
m o d u l a t i o n o f p r o t e i n s e c r e t i o n [ 2 5 ] . I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t s e c r e t i o n o f
s p e c i f i c p r o t e i n s w a s s t r o n g l y s t i m u l a t e d b y R U N X 2 - o v e r e x p r e s s i o n a n d
i n h i b i t e d b y R U N X 2 k n o c k - d o w n i n c e l l c u l t u r e m o d e l s , w h i l e o n l y
7
m i n i m a l c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n t h e i r o v e r a l l e x p r e s s i o n l e v e l s [ 2 5 ] .
O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S O B J E C T I V E S
T h i s r e p o r t g a v e r i s e t o t h e h y p o t h e s i s a d d r e s s e d i n t h e c u r r e n t t h e s i s , t h a t
R U N X 2 r e g u l a t e s R A N K L m e m b r a n e t r a f f i c k i n g . T h e h y p o t h e s i s s t a t e s t h a t
R U N X 2 - m e d i a t e d o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s o c c u r s b y r e g u l a t i n g
R A N K L m e m b r a n e t r a f f i c k i n g , n o t i t s o v e r a l l e x p r e s s i o n l e v e l .
8
M A T E R I A L S M A T E R I A L S M A T E R I A L S M A T E R I A L S A N D A N D A N D A N D M E T H O D S M E T H O D S M E T H O D S M E T H O D S
M a t e r i a l s M a t e r i a l s M a t e r i a l s M a t e r i a l s
R e a g e n t s a n d i n s t r u m e n t s u s e d i n t h i s t h e s i s a r e l i s t e d i n T a b l e s 1 , a n d 2 ,
r e s p e c t i v e l y .
M e t h o d s M e t h o d s M e t h o d s M e t h o d s
A n i m a l s a n d c e l l c u l t u r e
W i l d - t y p e m i c e ( C 5 7 B L / 6 ; J A X
®
m i c e ) w e r e o b t a i n e d f r o m t h e J a c k s o n
L a b o r a t o r y , S a c r a m e n t o , C A , U S A . A l l e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s w i t h
a n i m a l s w e r e a p p r o v e d b y t h e U S C I n s t i t u t i o n a l A n i m a l C a r e a n d U s e
C o m m i t t e e .
P r i m a r y o s t e o b l a s t s ( P O B s ) w e r e p r e p a r e d f r o m 1 - t o 2 - d a y o l d n e w b o r n
w i l d - t y p e m i c e b y c e l l d i g e s t i o n w i t h 1 m g / m l c o l l a g e n a s e P . p l u s 1 X
t r y p s i n ( 1 0 X ) i n D P B S . C e l l s w e r e c u l t u r e d f o r 3 - 6 d a y s t o c o n f l u e n c e p r i o r
t o u s e . P r i m a r y s p l e n o c y t e s w e r e p r e p a r e d f r o m 4 t o 6 - w e e k o l d a d u l t w i l d -
t y p e m i c e b y c e l l d i g e s t i o n w i t h r e d c e l l l y s i s b u f f e r , c o n s i s t i n g o f 0 . 7 4 %
N H
4
C l a n d 0 . 0 1 7 % T r i s - H C l ( 1 m M ) . R A W 2 6 4 . 7 c e l l s w e r e d e s c r i b e d b y
R a l p h P a n d N a k o i n z I [ 2 6 ] .
P r i m a r y o s t e o b l a s t s ( P O B s ) w e r e c u l t u r e d i n a l p h a m i n i m a l e s s e n t i a l
m e d i u m - a l p h a ( α M E M ) p l u s 2 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m a n d 1 % p e n i c i l l i n -
s t r e p t o m y c i n u n t i l c o n f l u e n c e . F o r e x p e r i m e n t s w i t h s e x h o r m o n e s , c e l l s
w e r e c u l t u r e d i n α M E M w i t h o u t p h e n o l r e d a n d w i t h 1 0 % C S S c h a r c o a l -
9
s t r i p p e d f e t a l b o v i n e s e r u m ( C S S ) a n d 1 % p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n .
P l a s m i d c o n s t r u c t i o n a n d t r a n s f e c t i o n
L e n t i v i r a l v e c t o r e n c o d i n g d o x y c y c l i n e ( d o x ) - i n d u c i b l e F L A G - R U N X 2 w a s
c o n s t r u c t e d b y B a n i w a l e t a l . [ 2 7 ] a n d u s e d t o p r o d u c e l e n t i v i r a l p a r t i c l e s a t
t h e U C L A V e c t o r c o r e , L o s A n g e l e s , C A , U S A . P O B s t r a n s d u c e d w i t h t h e s e
l e n t i v i r u s e s a r e d e s i g n a t e d P O B / R U N X 2
d o x
. T h e G F P - R A N K L p l a s m i d [ 2 0 ] ,
a g i f t f r o m D r . H i r o s h i S u z u k i , U n i v e r s i t y o f T o k y o , w a s i n t r o d u c e d i n t o
P O B s u s i n g t h e j e t P R I M E t r a n s f e c t i o n r e a g e n t a n d b u f f e r o r t h e
L i p o f e c t a m i n e L T X p l u s r e a g e n t a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l .
R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s w e r e g e n e r a t e d b y s t a b l y t r a n s f e c t i n g R A W
2 6 4 . 7 o s t e o c l a s t - l i k e c e l l s [ 1 6 ] w i t h a n N F κ B - l u c i f e r a s e r e p o r t e r p l a s m i d ( a
g i f t f r o m D r . E b r a h i m Z a n d i , U n i v e r s i t y o f S o u t h e r n C a l i f o r n i a , L o s
A n g e l e s , C A , U S A ) . A f t e r 2 - w e e k o f s e l e c t i o n i n 1 0 μ g / m l p u r o m y c i n ,
s t a b l y t r a n s f e c t e d R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e t e s t e d a n d f r o z e n f o r f u t u r e
e x p e r i m e n t s .
1 0
T a b l e T a b l e T a b l e T a b l e 1 . 1 . 1 . 1 . R e a g e n t s R e a g e n t s R e a g e n t s R e a g e n t s u s e d u s e d u s e d u s e d i n i n i n i n t h i s t h i s t h i s t h i s s t u d y s t u d y s t u d y s t u d y
N a m e o f M a t e r i a l s S o u r c e s
1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 S i g m a - A l d r i c h , S t L o u i s , M O , U S A
A m e r s h a m H y b o n d
T M
- P P V D F
m e m b r a n e s
G E H e a l t h c a r e , P i s c a t a w a y , N J . U S A
A u r u m
T M
t o t a l R N A m i n i k i t B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , H e r c u l e s , C A , U S A
C o l l a g e n a s e P . R o c h e D i a g n o s t i c s , I n d i a n a p o l i s , I N , U S A
C h a r c o l s t r i p p e d f e t a l b o v i n e s e r u m
( C S S )
G e m i n i , W e s t S a c r a m e n t o , C A , U S A
D o n k e y a n t i - m o u s e I g G a n t i b o d y ( H + L )
J a c k s o n I m m u n o r e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , W e s t G r o v e ,
P A , U S A
D o x C a l b i o c h e m , L a J o l l a , C A , U S A
D P B S C o r n i n g M e d i a t e c h , M a n a s s a s , V A , U S A
F e t a l b o v i n e s e r u m
O m e g a S c i e n t i f i c , T a r z a n a , C A , U S A o r G e m i n i B i o -
P r o d u c t s , W e s t S a c r a m e n t o , C A , U S A
H C l E M D C h e m i c a l s , B i l l e r i c a , M A , U S A
i Q ™ S Y B R
®
g r e e n s u p e r m i x B i o - R a d
i S c r i p t
T M
c D N A s y n t h e s i s k i t B i o - R a d
j e t P R I M E t r a n s f e c t i o n r e a g e n t a n d
b u f f e r
P o l y p l u s - T r a n s f e c t i o n , N e w Y o r k , N Y , U S A
L i p o f e c t a m i n e L T X a n d p l u s r e a g e n t I n v i t r o g e n , G r a n d I s l a n d , N Y , U S A
L u c i f e r a s e a s s a y s y s t e m
P r o m e g a , M a d i s o n , W I , U S A
M o u s e m o n o c l o n a l p r i m a r y a n t i b o d y
a g a i n s t F L A G
®
e p i t o p e ( M 2 )
S i g m a - A l d r i c h
N H 4 C l F i s h e r S c i e n t i f i c , F a i r L a w n , N J , U S A
P a s s i v e l y s i s b u f f e r P r o m e g a
P e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n ( 5 0 0 0 U / m l ) B i o r e a g e n t a n d C e l l C u l t u r e C o r e
P r o t e a s e i n h i b i t o r R o c h e D i a g n o s t i c s , I n d i a n a p o l i s , I N , U S A
q S c r i p t
T M
c D N A s u p e r m i x Q u a n t a B i o s c i e n c e , G a i t h e r s b u r g , M D , U S A
T R A P a s s a y k i t S i g m a - A l d r i c h
T r i s V W R I n t e r n a t i o n a l , W e s t C h e s t e r , P A , U S A
T y p s i n ( 1 0 X ) G i b c o , I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A , U S A
M i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m - α ( α M E M ) G i b c o
α M E M w i t h o u t p h e n o l r e d B i o r e a g e n t a n d C e l l C u l t u r e C o r e
F o r m a d e h y d e 3 7 % S o l u t i o n J . T . B a k e r , P h i l l i p s b u r g , N J , U S A
P B S ( 1 0 X ) B o s t o n B i o P r o d u c t s , A s h l a n d , M A , U S A
V e c t a s h i e l d m o u n t i n g m e d i u m f o r
f l u o r e s c e n c e ( w i t h D A P I )
V e c t o r L a b o r a t o r i e s , B u r l i n g a m e , C A , U S A
1 1
T a b l e T a b l e T a b l e T a b l e 2 . 2 . 2 . 2 . I n s t r u m e n t s I n s t r u m e n t s I n s t r u m e n t s I n s t r u m e n t s u s e d u s e d u s e d u s e d i n i n i n i n t h i s t h i s t h i s t h i s s t u d y s t u d y s t u d y s t u d y
N a m e o f M a c h i n e s N a m e o f C o m p a n i e s
C F X 9 6 T M R T - P C R s y s t e m B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , H e r c u l e s , C A , U S A
E c l i p s e T i , c o n f o c a l l a s e r - s c a n n i n g m i c r o s c o p e N i c o n i n s t r u m e n t , M e l v i l l e , N Y , U S A
V i c t o r T M 3 V , m u l t i - l a b e l c o u n t e r P e r k i n E l m e r , S h e l t o n , C T , U S A
W e s t e r n b l o t a n a l y s i s
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e p l a t e d a t 6 0 , 0 0 0 - 8 0 , 0 0 0 c e l l s / w e l l i n 6 - w e l l
p l a t e s i n α M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0
- 8
M 1 , 2 5 ( O H )
2
D
3
w i t h a n d w i t h o u t
5 0 0 n g / m l d o x f o r 4 8 h o u r s . C e l l s w e r e t h e n w a s h e d 3 t i m e s w i t h 1 X P B S
a n d l y s e d w i t h F 1 5 0 l y s i s b u f f e r [ 2 8 ] s u p p l e m e n t e d w i t h 1 X p r o t e a s e
i n h i b i t o r s m i x . C e l l l y s a t e w a s l o a d e d t o S D S - P A G E . P r o t e i n s i n t h e g e l
w e r e t r a n s f e r r e d t o A m e r s h a m H y b o n d
T M
- P P V D F m e m b r a n e s . M o u s e
m o n o c l o n a l p r i m a r y a n t i b o d y a g a i n s t F L A G
®
e p i t o p e , a n d a s e c o n d a r y
d o n k e y a n t i - m o u s e I g G a n t i b o d y ( H + L ) w e r e u s e d t o d e t e c t F L A G - R U N X 2 .
R N A e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e p l a t e d a t 6 0 , 0 0 0 - 8 0 , 0 0 0 c e l l s / w e l l i n 6 - w e l l
p l a t e s i n α M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0
- 8
M 1 , 2 5 ( O H )
2
D
3
w i t h a n d w i t h o u t
5 0 0 n g / m l d o x f o r 4 8 h o u r s . T o t a l R N A w a s e x t r a c t e d u s i n g A u r u m
T M
t o t a l
R N A m i n i k i t a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l a n d 1 μ g R N A w a s
r e v e r s e - t r a n s c r i b e d u s i n g i S c r i p t
T M
c D N A s y n t h e s i s k i t o r q S c r i p t
T M
c D N A
1 2
s u p e r m i x t o p r e p a r e c D N A . R e a l - t i m e q P C R a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d u s i n g
t h e C F X 9 6 T M R T - P C R s y s t e m a n d t h e i Q ™ S Y B R
®
G r e e n S u p e r m i x
a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . T h e p r i m e r s u s e d f o r q P C R a r e
l i s t e d i n T a b l e 3 . D a t a w e r e n o r m a l i z e d f o r t h e m R N A l e v e l s o f 6 0 S
r i b o s o m a l p r o t e i n L 1 0 a ( L 1 0 A ) , w h i c h t h e m s e l v e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y
a f f e c t e d b y t r e a t m e n t .
T a b l e T a b l e T a b l e T a b l e 3 . 3 . 3 . 3 . P r i m e r P r i m e r P r i m e r P r i m e r s e q u e n c e s s e q u e n c e s s e q u e n c e s s e q u e n c e s u s e d u s e d u s e d u s e d i n i n i n i n q P C R q P C R q P C R q P C R a n a l y s i s a n a l y s i s a n a l y s i s a n a l y s i s
P r i m e r S e q u e n c e s
m u r i n e R u n x 2 P r _ F
5 ’ - T C T T C C C A A A G C C A G A G T G G - 3 ’
P r _ R 5 ’ - A T C A G T T C C A T A G G T T G G A T T C - 3 ’
m u r i n e R A N K L P r _ F
5 ’ - G G G G G C C G T G C A G A A G G A A C - 3 ’
P r _ R
5 ’ - C T C A G G C T T G C C T C G C T G G G - 3 ’
m u r i n e O P G P r _ F 5 ’ - C T G C C T G G G A A G A A G A T C A G - 3 ’
P r _ R 5 ’ - A A A C A G C C C A G T G A C C A T T C - 3
m u r i n e O s t e o c l a c i n P r _ F
5 ’ - A C A A G T C C C A C A C A G C A G C T T - 3 ’
P r _ R
5 ’ - G C C G G A G T C T G T T C A C T A C C T - 3 ’
C o - c u l t u r e a n d T R A P a s s a y
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e s e e d e d a t 5 , 0 0 0 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s f o r a t
l e a s t 3 h o u r s b e f o r e s p l e n o c y t e s f r o m w i l d - t y p e a d u l t m i c e w e r e a d d e d a t
1 5 0 , 0 0 0 c e l l s / w e l l . O n D a y 1 , c o - c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h 1 0
- 8
M
1 , 2 5 ( O H )
2
D
3
w i t h o r w i t h o u t 5 0 0 n g / m l d o x . C e l l s w e r e c u l t u r e d f o r 7 , 1 1 ,
1 4 , 1 8 , a n d 2 1 d a y s . T h e c e l l c u l t u r e m e d i u m w a s r e p l a c e d e v e r y 3 d a y s .
A t e a c h t i m e p o i n t , a t a r t r a t e - r e s i s t a n t a c i d p h o s p h a t a s e ( T R A P ) s t a i n i n g
a s s a y w a s p e r f o r m e d u s i n g a T R A P a s s a y k i t f o l l o w i n g t h e m a n u f a c t u r e r ’ s
1 3
p r o t o c o l . I n t h i s a s s a y , m a t u r e o s t e o c l a s t s a r e s t a i n e d b a s e d o n t h e a c t i v i t y o f
t a r t r a t e - r e s i s t a n t a c i d p h o s p h a t a s e ( T R A P ) . O s t e o c l a s t s w e r e e n u m e r a t e d
b a s e d o n T R A P p o s i t i v i t y a n d t h e p r e s e n c e o f a t l e a s t t h r e e n u c l e i .
I m m u n o f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h t h e G F P - R A N K L e x p r e s s i o n v e c t o r
w e r e f i x e d w i t h f r e s h l y - m a d e f i x a t i o n s o l u t i o n ( 1 . 2 3 m l f o r m a l d e h y d e ( 3 7 % ) ,
7 . 5 m l 2 X P B S , a d d s t e r i l e w a t e r u p t o 1 5 m l ) a n d i n c u b a t e d w i t h m o u s e
m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t F L A G
®
e p i t o p e , f o l l o w e d b y t h e s e c o n d a r y
d o n k e y a n t i - m o u s e I g G a n t i b o d y ( H + L ) . C e l l s w e r e f i n a l l y m o u n t e d w i t h
V e c t a s h i e l d m o u n t i n g m e d i u m f o r f l u o r e s c e n c e ( w i t h D A P I ) . F L A G a n d
G F P f l u o r e s c e n c e w a s d e t e c t e d u s i n g a c o n f o c a l l a s e r - s c a n n i n g m i c r o s c o p e .
C o - c u l t u r e a n d l u c i f e r a s e a s s a y
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e s e e d e d a t 3 1 , 3 0 0 c e l l s / w e l l i n 2 4 - w e l l p l a t e s a n d
c o - c u l t u r e d w i t h R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s i n t w o d i f f e r e n t w a y s : A )
9 3 9 , 0 0 0 R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s c e l l s w e r e a d d e d t o w e l l s 2 4 h o u r s b e f o r e
e a c h t i m e p o i n t s ; B ) a f t e r P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e s e e d e d f o r 3 h o u r s ,
4 7 0 , 0 0 0 R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e s e e d e d p e r e a c h w e l l s , a n d c o - c u l t u r e d
d u r i n g t h e w h o l e t i m e c o u r s e . O n D a y 1 , c o - c u l t u r e s y s t e m w a s t r e a t e d w i t h
a n d w i t h o u t 5 0 0 n g / m l d o x , a n d w i t h 1 0
- 8
M 1 , 2 5 ( O H )
2
D
3 .
C e l l s w e r e
c u l t u r e d f o r 7 , 1 1 , 1 4 , 1 8 , o r 2 1 d a y s . T h e c e l l c u l t u r e m e d i u m w a s r e p l a c e d
e v e r y 2 d a y s .
1 4
A t e a c h t i m e p o i n t , c e l l s w e r e l y s e d b y p a s s i v e l y s i s b u f f e r a n d s u b j e c t e d t o
l u c i f e r a s e a s s a y u s i n g a l u c i f e r a s e a s s a y s y s t e m . L u c i f e r a s e a c t i v i t y w a s
m e a s u r e d u s i n g a V i c t o r l u m i n o m e t e r .
S t a t i s t i c a l a n a l y s i s
A l l a s s a y s w e r e p e r f o r m e d i n t r i p l i c a t e a n d r e s u l t s a r e p r e s e n t e d a s t h e
m e a n ± S D . P < 0 . 0 5 w a s c o n s i d e r e d s i g n i f i c a n t u s i n g S t u d e n t ’ s t t e s t .
1 5
R E S U L T S R E S U L T S R E S U L T S R E S U L T S
E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t E s t a b l i s h m e n t o f o f o f o f p r i m a r y p r i m a r y p r i m a r y p r i m a r y o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s ( P O B ) ( P O B ) ( P O B ) ( P O B ) c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y c o n d i t i o n a l l y e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g e x p r e s s i n g
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2 ( P O B / R U N X 2
d o x d o x d o x d o x
) ) ) )
R U N X 2 i s b e s t k n o w n f o r i t s r o l e i n o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d f u n c t i o n
[ 1 2 , 1 3 ] . D u r i n g a d u l t l i f e , o s t e o b l a s t s a r e c o n t i n u o u s l y e n g a g e d i n b o n e
f o r m a t i o n , w h i c h b a l a n c e s b o n e r e s o r p t i o n b y o s t e o c l a s t s [ 2 ] . F u r t h e r m o r e ,
o s t e o b l a s t s i n d i r e c t l y c o n t r o l b o n e r e s o r p t i o n b y r e g u l a t i n g o s t e o c l a s t
d i f f e r e n t i a t i o n . T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f R U N X 2 i n o s t e o b l a s t - d r i v e n
o s t e o c l a s t o g e n e s i s , w e e n g i n e e r e d m o u s e p r i m a r y o s t e o b l a s t s ( P O B s ) w i t h a
l e n t i v i r u s c o d i n g d o x y c y c l i n e - i n d u c i b l e F L A G - t a g g e d R U N X 2 . A s s h o w n i n
F i g u r e 1 A , F L A G - R U N X 2 m R N A l e v e l s w e r e s t r o n g l y i n d u c e d b y 2 4 h o f
d o x t r e a t m e n t a n d r e m a i n e d h i g h a t t h e 4 8 h a n d 7 2 h t i m e p o i n t s . I n d u c t i o n o f
F L A G - t a g g e d R U N X 2 w a s a l s o d e m o n s t r a t e d a t t h e p r o t e i n l e v e l ( F i g 1 B ) .
I m m u n o f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d e f f e c t i v e d o x - i n d u c i b l e
e x p r e s s i o n o f F L A G - R U N X 2 i n > 4 0 % o f t h e P O B s ( F i g 1 C - D ) . W e t h u s
e s t a b l i s h e d a t i g h t l y r e g u l a t e d s y s t e m f o r t h e c o n d i t i o n a l e x p r e s s i o n o f
R U N X 2 i n P O B s , w i t h e f f e c t i v e i n d u c t i o n o c c u r r i n g w i t h i n 2 4 h o u r s a n d
r e m a i n i n g s t a b l e f o r a t l e a s t 7 2 h o u r s .
1 6
F i g F i g F i g F i g 1 . 1 . 1 . 1 . T h e T h e T h e T h e e s t a b l i s h m e n t e s t a b l i s h m e n t e s t a b l i s h m e n t e s t a b l i s h m e n t o f o f o f o f P O B / R U N X 2 P O B / R U N X 2 P O B / R U N X 2 P O B / R U N X 2
d o x d o x d o x d o x
c e l l s . c e l l s . c e l l s . c e l l s . P r i m a r y o s t e o b l a s t s ( P O B ) w e r e t r a n s d u c e d w i t h
l e n t i v i r u s e s e n c o d i n g d o x - i n d u c i b l e F L A G - R U N X 2 a n d t r e a t e d w i t h e i t h e r 5 0 0 n g / m l d o x o r v e h i c l e .
A . F L A G - R U N X 2 m R N A l e v e l s w e r e m e a s u r e d b y R T - q P C R a f t e r t r e a t m e n t f o r 2 4 , 4 8 , a n d 7 2 h o u r s
( l e f t p a n e l , m i d d l e p a n e l a n d r i g h t p a n e l , r e s p e c t i v e l y ) . B . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f F L A G - R U N X 2 i n
w h o l e c e l l e x t r a c t s f r o m c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h o u r s . T u b u l i n w a s d e t e c t e d a s l o a d i n g c o n t r o l . C .
I m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o f c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h o u r s w i t h v e h i c l e ( t o p ) o r d o x ( b o t t o m ) . N u c l e i
a r e s t a i n e d w i t h D A P I ( b l u e ) a n d F L A G - R U N X 2 i s s t a i n e d w i t h r h o d a m i n e d o n k e y a n t i - m o u s e I g G
a n t i b o d y ( r e d ) . N o t e o n l y D A P I s t a i n i n g i n t h e u p p e r p a n e l v e r s u s a b u n d a n t r e d ( F L A G - R U N X 2 )
s t a i n i n g a t t h e b o t t o m . P u r p l e r e f l e c t s c o - s t a i n i n g f o r D A P I a n d F L A G - R U N X 2 . D . T h e p e r c e n t a g e
o f c e l l s p o s i t i v e f o r F L A G - R U N X 2 w a s d e t e r m i n e d b y c o u n t i n g t h e n u m b e r o f c e l l s p o s i t i v e f o r
F L A G i m m u n o f l u o r e s c e n c e ( a s s h o w n i n C ) o u t o f 1 0 0 c e l l s t h a t w e r e t r e a t e d w i t h e i t h e r d o x o r
v e h i c l e f o r 4 8 h o u r s .
1 7
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s t a r g e t t a r g e t t a r g e t t a r g e t g e n e g e n e g e n e g e n e e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , e x p r e s s i o n , b u t b u t b u t b u t n o t n o t n o t n o t
R A N K L R A N K L R A N K L R A N K L
A f t e r t h e s e t u p o f a c o n d i t i o n a l R U N X 2 e x p r e s s i o n s y s t e m , a n d b e f o r e
p u r s u i n g o u r s p e c i f i c q u e s t i o n o f h o w R U N X 2 m e d i a t e s o s t e o b l a s t - d r i v e n
o s t e o c l a s t o g e n e s i s , w e f i r s t c o n f i r m e d t h a t t h e d o x - i n d u c e d F L A G - R U N X 2
w a s f u n c t i o n a l . O s t e o c a l c i n i s a d i r e c t t a r g e t g e n e o f R U N X 2 . T h e g e n e ,
w h i c h e n c o d e s a b o n e - s p e c i f i c e x t r a c e l l u l a r m a t r i x p r o t e i n , h a s a 1 - k b
p r o x i m a l p r o m o t e r , w h i c h c o n f e r s o s t e o b l a s t - s p e c i f i c e x p r e s s i o n [ 2 9 , 3 0 ] a n d
c o n t a i n s O S E 2 , a c i s - a c t i n g e l e m e n t , t h a t b i n d R U N X 2 b o t h i n g e l - s h i f t a n d
C h I P a s s a y s [ 2 9 , 3 1 , 3 2 ] . A s s h o w n i n F i g 2 A , o s t e o c l a l c i n m R N A w a s
i n c r e a s e d b y o v e r 1 4 0 f o l d s a f t e r 4 8 - h r t r e a t m e n t w i t h 5 0 0 n g / m l d o x ,
c o m p a r e d t o v e h i c l e t r e a t m e n t w i t h o n l y 1 , 2 5 ( O H )
2
D
3 ,
i n d i c a t i n g t h a t t h e
d o x - i n d u c e d R U N X 2 p r o t e i n w a s f u n c t i o n a l .
W e u s e d t h e s a m e m R N A t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f R U N X 2 o n R A N K L a n d
O P G m R N A e x p r e s s i o n i n o u r s y s t e m . O P G m R N A , e n c o d i n g a d e c o y
r e c e p t o r o f R A N K L [ 1 6 ] , w a s s l i g h t l y b u t s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d b y 3 0 % i n
r e s p o n s e t o t h e o v e r e x p r e s s i o n o f R U N X 2 ( F i g 2 B ) . H o w e v e r , I n c o n t r a s t t o
t h e r e s u l t s o f G e o f f r o y e t a l , w h o o b s e r v e d a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n
R A N K L m R N A e x p r e s s i o n i n r e s p o n s e t o R U N X 2 [ 3 ] , d o x t r e a t m e n t o f t h e
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s d i d n o t r e s u l t i n a n y i n c r e a s e i n R A N K L m R N A ( F i g .
2 C ) . L 1 0 A m R N A , u s e d a s a “ l o a d i n g c o n t r o l ” d i d n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e
a n d w a s u s e d t o n o r m a l i z e t h e R T q P C R r e s u l t s . T h e L 1 0 A ( 6 0 S r i b o s o m a l
p r o t e i n L 1 0 a ) g e n e e n c o d e s a c y t o p l a s m i c c o m p o n e n t o f t h e 6 0 S r i b o s o m a l
1 8
s u b u n i t [ 3 3 ] a n d i t s s t a b l e e x p r e s s i o n c o m p a r t e d t o o t h e r p o p u l a r c o n t r o l s
( s u c h a s G A P D H a n d β - a c t i n m R N A ) m a k e s i t a m o s t s u i t a b l e c o n t r o l i n o u r
h a n d s .
F i g F i g F i g F i g 2 . 2 . 2 . 2 . E x p r e s s i o n E x p r e s s i o n E x p r e s s i o n E x p r e s s i o n o f o f o f o f R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 t a r g e t t a r g e t t a r g e t t a r g e t g e n e s . g e n e s . g e n e s . g e n e s . T o t a l R N A w a s i s o l a t e d f r o m P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s a f t e r
4 8 - h o u r d o x t r e a t m e n t f o r R T - q P C R a n a l y s i s o f o s t e o c a l c i n m R N A ( A ) , O P G m R N A ( B ) a n d O P G
m R N A ( C ) .
O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n O v e r e x p r e s s i o n o f o f o f o f R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 i n i n i n i n o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n o f o f o f o f c o - c o - c o - c o -
c u l t u r e d c u l t u r e d c u l t u r e d c u l t u r e d p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s p r e - o s t e o c l a s t s
O v e r - e x p r e s s i o n o f R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s i n v i v o c a u s e d b o n e l o s s a n d
f r a c t u r e s i n m i c e [ 2 , 2 3 ] . O v e r - e x p r e s s i o n o f R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s i n v i t r o
a c c e l e r a t e d d i f f e r e n t i a t i o n o f c o - c u l t u r e s m o n o c y t i c c e l l s i n t o m a t u r e
1 9
o s t e o c l a s t s [ 3 , 7 ] . W e w i s h e d t o c o n f i r m t h e a b i l i t y o f o u r d o x - i n d u c e d
F L A G - R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s t o s t i m u l a t e o s t e o c l a s t o g e n e s i s i n a c o - c u l t u r e
s y s t e m .
M a t u r e o s t e o c l a s t s a r e g i a n t , m u l t i - n u c l e a t e d c e l l s , w h i c h c a n b e d e t e c t e d
b a s e d o n e x p r e s s i o n o f t h e e n z y m e T a r t r a t e - R e s i s t a n t A c i d P h o s p h a t a s e
( T R A P ) . T R A P c a n b e d e m o n s t r a t e d h i s t o l o g i c a l l y b a s e d o n T R A P a c t i v i t y
t h a t c o n v e r t s t h e s u b s t r a t e n a p h t h o l A S - B I p h o s p h o r i c a c i d t o n a p h t h o l ,
w h i c h c a n b e d e t e c t e d a s d a r k - p u r p l e b y t h e i n t e r a c t i o n w i t h d i a z o t i z e d f a s t
g a r n e t G B C . W e c o - c u l t u r e s P O B / R x 2
d o x
c e l l s w i t h s p l e n o c y t e s o f a d u l t
w i l d t y p e m i c e f o r 5 d i f f e r e n t t i m e p o i n t s ( d a y 7 , 1 1 , 1 4 , 1 8 , 2 1 ) w i t h v e h i c l e
o r d o x t r e a t m e n t . T h e q u a n t i t y o f m a t u r e o s t e o c l a s t s d e r i v e d f r o m
s p l e n o c y t e s w e r e c o u n t e d a c c o r d i n g t o t h e T R A P s t a i n i n g .
C o m p a r e d t o c o n t r o l c u l t u r e s , w e o b s e r v e d i n t h e d o x - t r e a t e d w e l l s o n d a y 1 8
m a n y l a r g e , d a r k p u r p l e - s t a i n e d , m u l t i - n u c l e a t e d m a t u r e o s t e o c l a s t s ; f e w e r
p u r p l e - c o l o r e d c e l l s w e r e a l s o f o u n d i n t h e v e h i c l e g r o u p , b u t t h e y w e r e
m u c h s m a l l e r a n d r a r e l y m u l t i - n u c l e a t e d ( F i g u r e 3 A ) . T h u s , d o x - m e d i a t e d
R U N X 2 o v e r - e x p r e s s i o n i n o s t e o b l a s t s s t r o n g l y i n d u c e d o s t e o c l a s t
d i f f e r e n t i a t i o n . E n u m e r a t i o n o f T R A P - s t a i n e d c e l l s w i t h ≥ t h r e e n u c l e i
d e m o n s t r a t e d a 3 - f o l d i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f s u c h o s t e o c l a s t s i n t h e d o x -
t r e a t e d w e l l s o n d a y 7 , w i t h l i t t l e c h a n g e o n d a y 1 1 , 1 4 , 1 8 a n d 2 1 ( F i g u r e
3 B ) . T h e n u m b e r o f s u c h m u l t i n u c l e a t e d o s t e o c l a s t s i n t h e c o n t r o l c u l t u r e s
2 0
r e m a i n e d l o w a t a l l t i m e p o i n t s , r a n g i n g f r o m 5 % t o 3 0 % o f t h e r e s p e c t i v e
v a l u e s i n t h e d o x - t r e a t e d w e l l s . A l l t h e s e d a t a c o n f i r m t h a t t h e o v e r e x p r e s s i o n
o f R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s i n c r e a s e s t h e i r p o t e n c y t o s t i m u l a t e t h e
d i f f e r e n t i a t i o n o f o s t e o c l a s t s f r o m t h e i r p r e c u r s o r c e l l s .
F i g F i g F i g F i g 3 . 3 . 3 . 3 . O s t e o c l a s t O s t e o c l a s t O s t e o c l a s t O s t e o c l a s t m a t u r a t i o n m a t u r a t i o n m a t u r a t i o n m a t u r a t i o n w a s w a s w a s w a s s t i m u l a t e d s t i m u l a t e d s t i m u l a t e d s t i m u l a t e d b y b y b y b y R U N X 2 . R U N X 2 . R U N X 2 . R U N X 2 . S p l e e n o c y t e s w e r e c o - c u l t u r e d w i t h
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w i t h v e h i c l e o r d o x t r e a t m e n t . M a t u r e o s t e o c l a s t s w e r e s t a i n e d a n d c o u n t e d a t 5
t i m e p o i n t s . A . I m m a t u r e o s t e o c l a s t s w e r e s h o w n s m a l l , s i n g l e - n u c l e a t e d i n w e l l s t r e a t e d w i t h v e h i c l e
i n t h e l e f t p a n e l ; m a t u r e o s t e o c l a s t s w e r e g i a n t , T R A P - p o s i t i v e p u r p l e , a n d m u l t i - n u c l e a t e d i n w e l l s
t r e a t e d w i t h d o x , s h o w n i n t h e r i g h t p a n e l . B . T h e q u a n t i t i e s o f m a t u r e , m u l t i n u c l e a t e d o s t e o c l a s t s i n
v e h i c l e a n d d o x t r e a t m e n t g r o u p w e r e c o u n t e d . D a t a a r e t h e m e a n n u m b e r o f o s t e o c l a s t s p e r w e l l
( m e a n ± S D ; n = 3 w e l l s ) .
2 1
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n o f o f o f o f R A N K L R A N K L R A N K L R A N K L o n o n o n o n t h e t h e t h e t h e
o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t o s t e o b l a s t m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e
R A N K L i s t h e m o s t w e l l e s t a b l i s h e d m e c h a n i s m b y w h i c h o s t e o b l a s t s s i g n a l
t o m o n o c y t i c c e l l s t o d i f f e r e n t i a t e i n t o m u l t i n u c l e a t e d a c t i v e o s t e o c l a s t s . A s
d i s c u s s e d a b o v e , R A N K L m R N A w a s n o t b e s t i m u l a t e d b y t h e
o v e r e x p r e s s i o n o f R U N X 2 . S i n c e R U N X 2 w a s r e c e n t l y a s c r i b e d a r o l e i n
m e m b r a n e t r a f f i c k i n g a n d p r o t e i n s e c r e t i o n i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s [ 2 5 ] , w e
n e x t i n v e s t i g a t e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n p r o m o t e s
R A N K L m e m b r a n e p r e s e n t a t i o n .
W e w e r e u n a b l e t o d e t e c t e n d o g e n o u s R A N K L b y e i t h e r i m m u n o f l u o r e s c e n c e
o r w e s t e r n a n a l y s i s o f e i t h e r c o n d i t i o n e d m e d i u m o r w h o l e c e l l e x t r a c t s
p r e p a r e d f r o m c o n t r o l o r d o x - t r e a t e d P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s . D i f f i c u l t i e s t o
d e t e c t e n d o g e n o u s R A N K L w e r e r e p o r t e d , l i k e l y r e f l e c t i n g l o w e x p r e s s i o n
l e v e l s a n d / o r l a c k o f a n t i b o d i e s w i t h s u f f i c i e n t a f f i n i t y [ 1 6 ] , W e t h e r e f o r e
t o o k a n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h a n d i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f R U N X 2 o n t h e
c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f G F P - R A N K L e x p r e s s e d i n P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s b y
t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n .
G F P - R A N K L c o n s t r u c t s w e r e i n d u c e d i n t o P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s b y t r a n s i e n t
t r a n s f e c t i o n . A f t e r 2 4 , 4 8 a n d 7 2 - h o u r t r e a t m e n t w i t h d i f f e r e n t c o n d i t i o n s
( v e h i c l e a n d d o x ) , F L A G - R u n x 2 w e r e s t a i n e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n t
a n t i b o d i e s a g a i n s t F L A G . A s s h o w n i n F i g 4 A ( u p p e r p a n e l ) , w i t h 2 4 - h o u r
2 2
t r e a t m e n t , a l a r g e q u a n t i t y o f g r e e n v e s i c l e s c o n t a i n i n g G F P - R A N K L s p r e a d
t h r o u g h o u t t h e c y t o p l a s m a a w a y f r o m t h e n u c l e i a n d p r e s e n t e d o n t h e
m e m b r a n e . O n t h e c o n t r a r y , m o s t v e s i c l e s i n t h e v e h i c l e P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e c o n c e n t r a t e d t i g h t l y i n t h e p e r i - n u c l e a r a r e a w i t h f e w t r a n s p o r t i n g
a c t i v i t i e s t o w a r d t h e p l a s m i c m e m b r a n e . T h e n u c l e i o f P O B s w i t h d o x
t r e a t m e n t w e r e s t a i n e d r e d d u e t o t h e i n t r a n u c l e a r o v e r e x p r e s s i o n o f R U N X 2 ,
w h i l e n o R U N X 2 e x p r e s s i o n w a s d e t e c t e d i n t h e c o n t r o l g r o u p s i n c e t h e
n u c l e i r e m a i n e d b l u e b y D A P I s t a i n i n g . T o q u a n t i f y t h e e f f e c t o f R U N X 2 o n
t h e p r e s e n t a t i o n o f R A N K L o n t h e o s t e o b l a s t m e m b r a n e , w e r a n d o m l y
s e l e c t e d 1 0 c e l l s o f e a c h t r e a t m e n t g r o u p a n d t r a c k e d f o r e a c h c e l l t h e l e n g t h
o f p l a s m a m e m b r a n e t h a t w a s l a b e l e d b y G F P - R A N K L . W e t h e n m e a s u r e d
a n d e x p r e s s e d t h e G F P - R A N K L - l a b e l e d s u r f a c e a s a f r a c t i o n o f e a c h c e l l
c i r c u m f e r e n c e . A s s h o w n i n F i g u r e 4 C , G F P - R A N K L w a s p r e s e n t e d o n 3 . 9 %
o f t h e P O B / R U N X 2
d o x
c e l l m e m b r a n e s w i t h d o x t r e a t m e n t , h i g h e r t h a n t h a t
o f v e h i c l e t r e a t m e n t b y 4 f o l d s . I n 4 8 - h o u r t r e a t m e n t , s i m i l a r r e s u l t s w e r e
o b s e r v e d ( F i g 4 A . m i d d l e p a n e l ) . V e s i c l e s c o n t a i n i n g G F P - R A N K L w e r e
s p r e a d m o r e w i d e l y i n P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w i t h d o x t r e a t m e n t t h a n c e l l s
w i t h v e h i c l e t r e a t m e n t ( F i g 4 B ) . 3 . 9 % o f c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s o f
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e c o l o r e d b y G F P - R A N K L , a b o u t 4 - f o l d m o r e t h a n
v e h i c l e c e l l s ( F i g 4 C ) . A f t e r 7 2 - h o u r t r e a t m e n t o f d o x , t h e r e w e r e o b v i o u s l y
m o r e R A N K L p r e s e n t e d o n t h e p l a s m i c m e m b r a n e s o f P O B s t o s o m e e x t e n t ,
w h i l e m o s t G F P - R A N K L v e s i c l e s r e m a i n e d c o n c e n t r a t e d a r o u n d n u c l e i o f
c e l l s w i t h v e h i c l e t r e a t m e n t ( F i g 4 A , b o t t o m p a n e l ) . G F P - R A N K L w a s
p r e s e n t e d o n 5 . 9 % o f c e l l m e m b r a n e s , w h i c h i s 2 . 6 - f o l d h i g h e r t h a n t h a t o f
v e h i c l e c e l l s . I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t t h e l e v e l o f m e m b r a n e
2 3
p r e s e n t a t i o n o f R A N K L a f t e r t r e a t e d w i t h d o x f o r 7 2 h o u r s i s a l s o 5 0 %
h i g h e r , c o m p a r e d t o t h e 2 4 - a n d 4 8 - h o u r t r e a t m e n t , p o s s i b l y d u e t o t h e l o n g e r
p e r i o d o f R U N X 2 m e d i a t i o n ( F i g 4 C ) . H o w e v e r , t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f
G F P - R A N K L i n g e n e r a l w e r e d e c r e a s e d , i n d i c a t i n g t h e d e g r a d a t i o n o f
i n d u c e d G F P - R A N K L . A l l t h e s e d a t a s h o w t h a t i n s t e a d o f t h e e x p r e s s i o n
l e v e l , t h e t r a n s p o r t i n g a n d m e m b r a n e p r e s e n t i n g l e v e l o f R A N K L w a s u p -
r e g u l a t e d s i g n i f i c a n t l y b y a h i g h l e v e l o f R U N X 2 , i n a t i m e p e r i o d - r e l a t e d
m a n n e r . A n d a l s o , a m o r e s t a b l e m e t h o d i s n e e d e d t o f u r t h e r t e s t t h e f u n c t i o n
o f R U N X 2 o n R A N K L a n d o s t e o c l a s t o g e n e s i s i n a l o n g e r t i m e c o u r s e i n t h e
f u t u r e .
R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n o v e r e x p r e s s i o n i n i n i n i n o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s o s t e o b l a s t s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s s t i m u l a t e s N F N F N F N F κ κ κ κ B B B B s i g n a l i n g s i g n a l i n g s i g n a l i n g s i g n a l i n g i n i n i n i n c o - c o - c o - c o -
c u l t u r e d c u l t u r e d c u l t u r e d c u l t u r e d o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c c e l l s c e l l s c e l l s c e l l s
I f t h e e f f e c t o f R U N X 2 o n R A N K L t r a f f i c k i n g ( F i g 4 ) w e r e s h a r e d b y
e n d o g e n o u s R A N K L , t h e n i n c r e a s e d m e m b r a n e t r a f f i c k i n g o f t h e l a t t e r
w o u l d r e s u l t i n i n c r e a s e d N F k B s i g n a l i n g i n t a r g e t c e l l s [ 3 4 ] , l e a d i n g t o t h e
o b s e r v e d i n c r e a s e i n o s t e o c l a s t o g e n e s i s ( F i g 3 ) .
T o t e s t w h e t h e r R U N X 2 o v e r - e x p r e s s i o n i n P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s i n d e e d
i n d u c e d N F κ B s i g n a l i n g i n c o - c u l t u r e d c e l l s , w e f i r s t g e n e r a t e d a r e p o r t e r c e l l
l i n e . R A W 2 6 4 . 7 , a n o s t e o c l a s t p r e c u r s o r - l i k e c e l l l i n e , w e r e s t a b l y
t r a n s f e c t e d w i t h a n N F κ B - l u c i f e r a s e r e p o r t e r p l a s m i d . A f t e r s e l e c t i o n i n
2 4
F i g F i g F i g F i g 4 . 4 . 4 . 4 . G F P - R A N K L G F P - R A N K L G F P - R A N K L G F P - R A N K L m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e m e m b r a n e p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n p r e s e n t a t i o n w a s w a s w a s w a s i n c r e a s e d i n c r e a s e d i n c r e a s e d i n c r e a s e d b y b y b y b y R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 . G F P - R A N K L w a s
t r a n s i e n t l y e x p r e s s e d i n P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s a n d v i s u a l i z e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e ( g r e e n ) a l o n g
w i t h F L A G - R U N X 2 i t s e l f ( r e d ) . A . C o - d e t e c t i o n o f G F P - R A N K L a n d F L A G - R U N X 2 a f t e r 2 4 - , 4 8 - ,
a n d 7 2 - h o u r d o x t r e a t m e n t ( u p p e r p a n e l , m i d d l e p a n e l , a n d b o t t o m p a n e l , r e s p e c t i v e l y ) . N u c l e i w e r e
s t a i n e d w i t h D A P I . N o t e t h e n u c l e i a p p e a r p u r p l e w h e n F L A G - R U N X 2 i s e x p r e s s e d ( r i g h t p a n e l s ) . B .
A n e n l a r g e m e n t o f t h e 4 8 - h o u r t r e a t e d c e l l s f r o m A . N o t e t h a t G F P - R A N K L i s m o s t l y p e r i n u c l e a r i n
t h e a b s e n c e o f R U N X 2 , v e r s u s a w i d e r s p r e a d i n t h e c y t o p l a s m a n d a h i g h e r l e v e l o f m e m b r a n e
p r e s e n t a t i o n o f G F P - R A N K L i n t h e p r e s e n c e o f F L A G - R U N X 2 ( b o t t o m p a n e l ) . C . T h e G F P -
c o n t a i n i n g m e m b r a n e l e n g t h w a s c a l c u l a t e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e w h o l e c e l l p e r i m e t e r f o r 1 0 c o n t r o l
c e l l s a n d 1 0 c e l l s e x p r e s s i n g R U N X 2 f o r 2 4 , 4 8 a n d 7 2 h o u r s a s i n d i c a t e d ( m e a n ± S D ) . . . .
1 0 u g / m l p u r o m y c i n f o r t w o w e e k s , t h e R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e t e s t e d b y
t r e a t m e n t w i t h T N F - α f o r 5 h o u r s . A s s h o w n i n F i g u r e 5 A , T N F - α i n c r e a s e d
l u c i f e r a s e a c t i v i t y i n t h e R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s s t r o n g l y a n d d o s e -
d e p e n d e n t l y b y 8 f o l d s ( F i g 5 A ) .
2 5
I n o u r c o - c u l t u r e s y s t e m , w e c a n n o t o n l y t e s t h o w t h e R A N K L - R A N K
i n t e r a c t i o n r e g u l a t e s i n o s t e o c l a s t o g e n i c p r o c e s s , b u t a l s o h o w t h e l o n g - t e r m
c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n n e t f u n c t i o n s i n t h i s p r o c e s s . I n o u r f i r s t t e s t ,
P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h e i t h e r d o x o r v e h i c l e f o r 5 d i f f e r e n t
t i m e p o i n t s . R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e a d d e d i n t o w e l l s o n e d a y b e f o r e e a c h
t i m e p o i n t a n d c o - c u l t u r e d w i t h P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s f o r 2 4 h o u r s . A s s h o w n
i n F i g 5 B , t h e r e l a t i v e l u c i f e r a s e u n i t s o f R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e a l l
s i g n i f i c a n t l y h i g h e r w i t h d o x t r e a t m e n t a t a l l f i v e t i m e p o i n t s t h a n v e h i c l e
c e l l s b y o v e r 3 0 f o l d s . T h i s i n d i c a t e s t h a t R A N K L , p r e s e n t e d b y d o x -
m e d i a t e d R U N X 2 o v e r e x p r e s s i o n , u p r e g u l a t e d t h e N F κ B - l u c i f e r a s e
e x p r e s s i o n v i a R A N K L - R A N K i n t e r a c t i o n , a n d t h i s f u n c t i o n r e m a i n e d i n t h e
w h o l e t i m e c o u r s e . H o w e v e r , t h e i n t e n s i t y o f l u c i f e r a s e u n i t s w e r e n o t q u i t e
s t a b l e , r a n g i n g f r o m 2 7 f o l d s t o 1 2 8 f o l d s . T h e s e r e s u l t s b r o u g h t o u t a n e w
q u e s t i o n a b o u t o u r 2 4 - h o u r c o - c u l t u r e s y s t e m . T h u s , i n o u r n e x t t e s t , R A W
2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s w e r e s e e d e d a n d c o - c u l t u r e d w i t h P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s f o r t h e
w h o l e d u r a t i o n . I n t e r e s t i n g l y , w h e n t h e s t r e n g t h o f l u c i f e r a s e o f c e l l s w a s
a n a l y s e d ( o n l y 3 t i m e p o i n t s w e r e s h o w n i n F i g 5 C ) , t h e r e l a t i v e u n i t s l e v e l
o f d o x t r e a t m e n t g r o u p w a s s t i l l s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f v e h i c l e c e l l s .
I n d a y 7 , t h e l u c i f e r a s e u n i t s w e r e i n c r e a s e d b y 3 0 % w i t h d o x t r e a t m e n t
c o m p a r e d t o v e h i c l e t r e a t m e n t . I n d a y 1 4 a n d 1 8 , t h e l u c i f e r a s e u n i t s o f d o x -
t r e a t e d c o - c u l t u r e c e l l s w e r e 2 - f o l d a n d 3 - f o l d h i g h e r t h a n v e h i c l e c e l l s ,
r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e s t i m u l a t i o n l e v e l o f l u c i f e r a s e s t r e n g t h p e r s e w a s
s o m e h o w a t t e n u a t e d s i g n i f i c a n t l y c o m p a r i n g t o t h e r e s u l t s o f 2 4 - h o u r c o -
c u l t u r e s y s t e m . T h i s d i s c o v e r y s u g g e s t e d t h a t b e s i d e s R A N K L s i g n a l i n g ,
t h e r e m i g h t b e o t h e r u n k n o w n m e c h a n i s m s r e g u l a t e o s t e o c l a s t o g e n e s i s v i a
2 6
t h e c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n b e t w e e n o s t e o b l a s t s a n d o s t e o c l a s t p r e c u r s o r s , w h i c h
m i g h t b e m u c h s l o w e r t h a n R A N K L p a t h w a y . N e g a t i v e g r o u p s w e r e a l s o s e t
u p b y t r e a t i n g R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s a l o n e w i t h e i t h e r v e h i c l e o r d o x f o r 2 4
h o u r s a n d a l s o f o r t h e l o n g d u r a t i o n . T h e r e s u l t s w e r e s i m i l a r b e t w e e n v e h i c l e
a n d d o x t r e a t m e n t ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g e i t h e r d o x i t s e l f o r d o x -
i n d u c e d R U N X 2 h a d n o i n f l u e n c e o n R A W 2 6 4 . 7
N F κ B
c e l l s . A l l t h e s e d a t a
i n d i c a t e t h a t R A N K L , p r e s e n t e d o n t h e m e m b r a n e o f o s t e o b l a s t s a t h i g h
l e v e l s b y R U N X 2 s t i m u l a t i o n , u p r e g u l a t e s t h e o s t e o c l a s t o g e n e s i s v i a b i n d i n g
a n d i n t e r a c t i n g w i t h R A N K . I n t h e m e a n t i m e , o t h e r m e c h a n i s m s m i g h t b e
a l s o i n v o l v e d i n t h e o s t e o c l a s t o g e n i c p r o c e s s i n t h e c o n t e x t o f c e l l - c e l l
i n t e r a c t i o n b e t w e e n o s t e o b l a s t s a n d p r e - o s t e o c l a s t s .
2 7
F i g F i g F i g F i g 5 . 5 . 5 . 5 . R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 R U N X 2 e x p r e s s i o n e x p r e s s i o n e x p r e s s i o n e x p r e s s i o n i n i n i n i n P O B s P O B s P O B s P O B s i n c r e a s e s i n c r e a s e s i n c r e a s e s i n c r e a s e s N F N F N F N F κ κ κ κ B B B B a c t i v i t y a c t i v i t y a c t i v i t y a c t i v i t y i n i n i n i n c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d c o - c u l t u r e d o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c o s t e o c l a s t i c c e l l s . c e l l s . c e l l s . c e l l s . A .
E s t a b l i s h m e n t o f R A W - 2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s . R A W 2 6 4 . 7 c e l l s w e r e s t a b l y t r a n s f e c t e d w i t h a n
N F κ B - l u c i f e r a s e r e p o r t e r p l a s m i d a n d t r e a t e d f o r 5 h o u r s w i t h 2 0 n g / m l T N F - α i n α M E M m e d i u m
w i t h c h a r c o a l - s t r i p p e d s e r u m o r v e h i c l e a s i n d i c a t e d . B . P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c e
o f e i t h e r v e h i c l e o r d o x f o r 7 , 1 1 , 1 4 , 1 8 o r 2 1 d a y s a s i n d i c a t e d . R A W - 2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s w e r e
a d d e d a n d t o t h e P O B c u l t u r e s f o r 2 4 h o u r s p r i o r t o h a r v e s t a n d l u c i f e r a s e a s s a y . N o t e s t r o n g
i n d u c t i o n o f l u c i f e r a s e a c t i v i t y b y t h e d o x - t r e a t e d a s c o m p a r e d t o v e h i c l e - t r e a t e d P O B s . C . R A W -
2 6 4 . 7
N F κ B
r e p o r t e r c e l l s w e r e p l a t e d a l o n g w i t h P O B / R U N X 2
d o x
c e l l s o n d a y 1 a n d t h e c o - c u l t u r e s
w e r e t r e a t e d w i t h d o x o r v e h i c l e . L u c i f e r a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d o n d a y s 7 , 1 4 a n d 1 8 . L u c i f e r a s e
a c t i v i t y w a s m e a s u r e d . I n A - C , t h e v a l u e s r e p r e s e n t M e a n ± S D o f 3 w e l l s .
2 8
D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N D I S C U S S I O N
R U N X 2 p l a y s a p i v o t a l r o l e i n o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e
d e v e l o p m e n t [ 2 3 ] . O n t h e o t h e r h a n d , o v e r e x p r e s s i o n o f R U N X 2 i n
o s t e o b l a s t s w a s r e p o r t e d t o s t i m u l a t e b o n e r e s o r p t i o n , r e s u l t i n g i n o s t e o p e n i a
a n d s p o n t a n e o u s f r a c t u r e s [ 2 , 3 , 3 8 ] . F u r t h e r m o r e , i n h i b i t i o n o f R U N X 2
a c t i v i t y i n o s t e o b l a s t s d e c r e a s e s t h e i r o s t e o c l a s t o g e n i c p o t e n t i a l a n d i n c r e a s e s
b o n e m a s s . S o f a r , t h e i n v o l v e m e n t o f R A N K L i n R U N X 2 - m e d i a t e d
o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s h a s b e e n u n c l e a r [ 2 2 ] .
I n t h i s r e p o r t , w e t e s t e d t h e o s t e o c l a s t o g e n i c f u n c t i o n o f R U N X 2 a n d t h e
i n v o l v e m e n t o f R A N K L u s i n g a n o v e l e x p e r i m e n t a l s y s t e m . W e e s t a b l i s h e d a
h i g h l y e f f i c i e n t l e n t i v i r a l s y s t e m t o i n d u c e F L A G - R U N X 2 e x p r e s s i o n i n
m u r i n e p r i m a r y o s t e o b l a s t s . T h i s e x p e r i m e n t a l s y s t e m a l l o w e d u s t o
c o n d i t i o n a l l y e x p r e s s R U N X 2 b y t r e a t i n g c e l l s w i t h d o x y c y c l i n e a n d t h e n
m e a s u r e e f f e c t s o n o s t e o c l a s t o g e n e s i s , m R N A e x p r e s s i o n , R A N K L
m e m b r a n e t r a f f i c k i n g a n d a c t i v a t i o n o f N F κ B i n t a r g e t c e l l s . U p o n d o x -
m e d i a t e d R U N X 2 e x p r e s s i o n w e o b s e r v e d i n c r e a s e d m e m b r a n e t r a f f i c k i n g i f
t r a n s i e n t l y - t r a n s f e c t e d R A N K L ( F i g 4 ) , i n c r e a s e d N F κ B a c t i v i t y i n c o -
c u l t u r e d N F κ B - l u c i f e r a s e r e p o r t e r c e l l s ( F i g 5 ) , a n d i n c r e a s e d d i f f e r e n t i a t i o n
o f c o - c u l t u r e d s p l e n o c y t e s i n t o m a t u r e o s t e o c l a s t s ( F i g 3 ) .
2 9
E v e n t h o u g h o u r r e s u l t s c o l l e c t i v e l y i n d i c a t e t h a t R U N X 2 i n c r e a s e s t h e
o s t e o c l a s t o g e n i c p o t e n t i a l o f o s t e o b l a s t s b y p r o m o t i n g R A N K L t r a f f i c k i n g ,
t h i s r e m a i n s t o b e d i r e c t l y d e m o n s t r a t e d . W e w e r e u n a b l e t o s h o w i t d i r e c t l y
b e c a u s e w e c o u l d n o t o b t a i n a n t i b o d i e s o f s u f f i c i e n t q u a l i t y f r o m c o m m e r c i a l
s o u r c e s . W e t h e r e f o r e r e s o r t e d t o i n v e s t i g a t i n g R A N K L t r a f f i c k i n g u s i n g a
t r a n s i e n t l y e x p r e s s e d R A N K L - G F P f u s i o n p r o t e i n . F u t u r e w o r k i s n e e d e d t o
h o p e f u l l y c o n f i r m t h e e f f e c t o f R U N X 2 o n R A N K L m e m b r a n e p r e s e n t a t i o n
w h e n a n a l y z i n g e n d o g e n o u s R N A K L . A n o t h e r l i m i t a t i o n o f o u r w o r k i s t h a t
w e c o u l d n o t m e a s u r e s e c r e t e d R A N K L . A g a i n , t h i s i s l i k e l y d u e i n s u f f i c i e n t
q u a l i t y o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a n t i b o d i e s , a s n o t e d b y o t h e r r e s e a r c h e r s
[ 1 6 ] . R A N K L e x i s t s i n t w o f o r m s i n t h e c o n t e x t o f b o n e m o d u l a t i o n : s o l u b l e
R A N K L i s s e c r e t e d i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t f r o m t h e o s t e o b l a s t s ,
w h i l e a m e m b r a n e - b o u n d R A N K L i s p r e s e n t e d o n t h e o s t e o b l a s t s s u r f a c e
[ 1 6 ] . W e s t u d i e d o n l y t h e l a t t e r f o r m , a n d w e d i d s o i n d i r e c t l y u s i n g G F P -
R A N K L . U s i n g c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a n t i b o d i e s w e c o u l d n o t e v e n d e t e c t
t h e i n d u c e d G F P - R A N K L b y w e s t e r n a n a l y s i s o f e i t h e r c o n d i t i o n e d m e d i a o r
w h o l e - c e l l e x t r a c t s ( d a t e n o t s h o w n ) . W e a r e c u r r e n t l y a t t e m p t i n g t o m e a s u r e
s e c r e t e d R A N K L b y E L I S A v i a c o l l a b o r a t i o n w i t h i n v e s t i g a t o r s a t A m g e n .
W e a r e a l s o c o l l a b o r a t i n g w i t h A m g e n o n d e v e l o p i n g a p r o b e t o d i r e c t l y
d e t e c t R A N K L o n t h e o s t e o b l a s t m e m b r a n e . S p e c i f i c a l l y , i n v e s t i g a t o r s a t
A m g e n s y n t h e s i z e d a n F c - F I T C - R A N K p r o b e m o l e c u l e s , w h i c h i s s u p p o s e d
t o s t r o n g l y b i n d R A N K L m o l e c u l e s p r e s e n t e d o n t h e o s t e o b l a s t s u r f a c e . A
n e g a t i v e c o n t r o l F c - F I T C w a s a l s o s y n t h e s i z e d , w h i c h w o u l d i n d i c a t e t h e
3 0
n o n - s p e c i f i c b i n d i n g t o t h e c e l l s u r f a c e . D e s p i t e s i g n i f i c a n t e f f o r t s . ( d i f f e r e n t
w a y s o f s t i m u l a t i n g R A N K L , d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f b l o c k i n g s e r u m
a n d / o r p r o b e s , a n d d i f f e r e n t i n c u b a t i o n d u r a t i o n o f l i v e c e l l s w i t h p r o b e s ) w e
c o u l d n o t f i n d c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d
b e t w e e n t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f t h e s p e c i f i c F c - F I T C - R A N K p r o b e a n d
t h a t o f t h e n o n - s p e c i f i c F c - F I T C c o n t r o l . F u r t h e r w o r k i s w a r r a n t e d t o e i t h e r
f i n d b e t t e r c o n d i t i o n s o r s y n t h e s i z e a n i m p r o v e d p r o b e a t A m g e n .
W e a r e a l s o g e n e r a t i n g R A N K L - F L A G p l a s m i d s , w i t h w h i c h f u t u r e w o r k
m a y b e a b l e t o d e m o n s t r a t e e f f e c t s o f R U N X 2 o n s e c r e t e d R A N K L , a l b e i t
i n d i r e c t l y .
E v e n i f w e a r e a b l e t o d i r e c t l y c o n f i r m e f f e c t s o f R A N K L o n t r a f f i c k i n g o f
e n d o g e n o u s R A N K L t o t h e o s t e o b l a s t s u r f a c e a n d / o r i t s s e c r e t i o n t o t h e
e x t r a c e l l u l a r s p a c e , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t R U N X 2 e m p l o y s a d d i t i o n a l
m e c h a n i s m ( s ) i n p r o m o t i n g o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s . T h i s v i e w
i s b a s e d o n t h e f a c t t h a t o v e r e x p r e s s i o n o f s o l u b l e R A N K L w a s i n s u f f i c i e n t
t o i n d u c e a c o m p l e t e o s t e o c l a s t o g e n i c r e a c t i o n i n R U N X 2
- / -
t r a n s g e n i c
m i c e [ 2 2 ] . A s d a t a r e v e a l s , t h e e x p r e s s i o n o f s R A N K L t r a n s g e n e i n v i v o w a s
s u f f i c i e n t t o i n c r e a s e t h e a m o u n t o f T R A P - p o s i t i v e o s t e o c l a s t s a s a
c o n s e q u e n c e o f s t i m u l a t i n g o s t e o c l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d a c t i v a t i o n . H o w e v e r ,
f u r t h e r m o r p h o l o g i c a l d e v e l o p m e n t a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s w e r e p o o r t o b e
d e t e c t e d i n t h e s e m i c e c o m p a r e d t o w i l d t y p e l i t t e r m a t e s , w h i c h s h o w s t h e
3 1
r o l e o f R U N X 2 i n m e d i a t i n g o s t e o c l a s t o g e n e s i s i s p i v o t a l b u t n o t b y s i m p l y
r e g u l a t i n g R A N K L e x p r e s s i o n [ 2 2 ] . O t h e r m o l e c u l e s a n d / o r m a c h i n e r i e s o f
t h e o s t e o b l a s t - o s t e o c l a s t i n t e r a c t i v e n e t w o r k b e s i d e s R A N K L m a y b e
s t i m u l a t e d b y R U N X 2 a n d t o p r o m o t e t h e o s t e o c l a s t o g e n i c p r o c e s s .
I n t h i s r e p o r t , a l l t h e e x p e r i m e n t s w e r e d o n e i n v i t r o . E x p e r i m e n t s i n v i v o
t h a t a r e a b l e t o r e p l i c a t e a n d s u p p o r t o u r i n v i t r o r e s u l t s a r e n e c e s s a r y t o
s u b s t a n t i a t e t h e p r o p o s e d w o r k i n g m o d e l s t a t i n g R U N X 2 m e d i a t e s
o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s t h r o u g h R A N K L t r a f f i c k i n g .
O v e r e x p r e s s i n g R U N X 2 , c o m b i n e d w i t h e i t h e r s u p p r e s s i o n o r
o v e r e x p r e s s i o n o f R A N K L r e p o r t e r c o n s t r u c t s ( e . g . G F P - R A N K L ) i n
t r a n s g e n i c m i c e m a y p r o v i d e t h e n e c e s s a r y i n v i v o e v i d e n c e f o r t h e r o l e o f
R A N K L t r a f f i c k i n g i n R U N X 2 - m e d i a t e d o s t e o b l a s t - d r i v e n
o s t e o c l a s t o g e n e s i s .
E x p e r i m e n t s c o n d u c t e d i n t h i s t h e s i s r e l i e d o n R U N X 2 i n d u c t i o n u s i n g
l e n t i v i r u s e s . F u t u r e w o r k i s w a r r a n t e d t o s u p p o r t o u r w o r k i n g m o d e l b y
i n h i b i t i n g R U N X 2 i n o s t e o b l a s t s , i n w h i c h e n d o g e n o u s R U N X 2 s u p p o s e d l y
m e d i a t e s o s t e o c l a s t o g e n e s i s . T h i s c a n b e d o n e , f o r e x a m p l e , w i t h c e l l s f r o m
R U N X 2 k n o c k o u t ( o r c o n d i t i o n a l k n o c k o u t ) m i c e , o r w i t h R U N X 2 s i R N A
[ 3 5 ] t o r e p r e s s R U N X 2 e x p r e s s i o n i n v i t r o . A l t e r n a t i v e l y , d o m i n a n t n e g a t i v e -
R U N X 2 c a n b e u s e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d [ 7 , 2 2 , 2 3 , 3 6 ] . T h i s c a n b e d o n e
i n v i v o , t o t e s t t h e r o l e o f R U N X 2 i n t h e c o n t e x t o f t h e w h o l e o r g a n i s m , o r
3 2
p r i m a r y o s t e o b l a s t s c a n b e p r o d u c e d f r o m m o u s e m o d e l s f o r e x p e r i m e n t s i n
v i t r o . A c c o r d i n g t o t h e s e t e c h n i q u e s , w e c a n e s t a b l i s h a k n o c k o u t s y s t e m o f
R U N X 2 t o t e s t h o w t h e c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n p a t h w a y s r e a c t i n t h e a b s e n c e o f
R U N X 2 i n b o t h i n v i v o a n d i n v i t r o . B a s e d o n o u r u n d e r s t a n d i n g o f R U N X 2 -
m e d i a t e d o s t e o b l a s t - d r i v e n o s t e o c l a s t o g e n e s i s , t h e e x p r e s s i o n l e v e l s a n d
p o s t - t r a n s l a t i o n a c t i v i t y l e v e l s o f R A N K L n e e d t o b e m e a s u r e d , a s w e l l a s
m a r k e r f a c t o r s o f m a t u r e o s t e o c l a s t s . A n d a d e c r e a s e o f R A N K L m e m b r a n e
p r e s e n t a t i o n a n d o s t e o c l a s t m a t u r a t i o n l e v e l s a r e e x p e c t e d , w i t h o u t c h a n g e s
i n R A N K L m R N A .
O u r r e s u l t s m a y c o n t r i b u t e t o t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e r o l e o f s e x s t e r o i d s
( m a i n l y e s t r o g e n a n d a n d r o g e n ) i n b o n e m e t a b o l i s m . S e x s t e r o i d r e c e p t o r s
e s t r o g e n r e c e p t o r α ( E R α ) , E R β , a n d a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) w e r e r e p o r t e d
p r e s e n t i n g i n t h e c a r t i l a g e a n d b o n e t i s s u e [ 3 7 ] . L o s s o f e s t r o g e n s i n m e n a n d
w o m e n a n d a n d r o g e n s i n m e n i n c r e a s e s t h e r i s k o f o s t e o p e n i c f r a c t u r e s [ 3 8 ] .
O s t e o p o r o s i s a s s o c i a t e d w i t h l o s s o f s e x s t e r o i d s i s a t t r i b u t a b l e t o h i g h b o n e
t u r n o v e r a n d h o r m o n e r e p l a c e m e n t t h e r a p y w i t h e s t r o g e n s o r s y n t h e t i c
e s t r o g e n - l i k e d r u g s i s a n e f f e c t i v e a p p r o a c h t o p r e v e n t t h e i n c r e a s e d
o s t e o c l a s t o g e n e s i s a n d b o n e r e s o r p t i o n o b s e r v e d i n p o s t - m e n o p a u s a l w o m e n
[ 3 9 ] . H o w e v e r , t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h e b o n e - s p a r i n g
e f f e c t s o f s e x s t e r o i d s a r e n o t f u l l y u n d e r s t o o d . S i n c e s e x s t e r o i d s w e r e
r e p o r t e d t o p r e v e n t b o n e l o s s a n d f r a c t u r e s , w e s u p p o s e t h a t R A N K - R A N K L
i n t e r a c t i o n m e d i a t e d b y R U N X 2 , w h i c h c o u l d s t i m u l a t e o s t e o c l a s t o g e n e s i s , i s
o n e o f t h e s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t a r e i n h i b i t e d b y s e x s t e r o i d s . H e n c e , i n t h e
3 3
f u t u r e , t h e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s o f i n h i b i t o r y r e g u l a t i o n o f s e x s t e r o i d s o n
R U N X 2 - m e d i a t e d o s t e o c l a s t o g e n e s i s v i a R A N K L p r e s e n t a t i o n w o u l d b e a n
i n t e r e s t i n g a r e a o f r e s e a r c h .
3 4
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Abstract (if available)
Abstract
In mammalian bodies, bones are continuously remodeled via two processes: bone formation and bone resorption. RUNX2, used to be recognized as activator of osteoblast differentiation (i.e. bone formation), are recently accepted to also function in osteoclastogenesis which leads to bone resorption consequently, via RANKL-RANK interaction between osteoblasts and osteoclasts. In this report, on the base of the establishment of dox-induced RUNX2 overexpression in mouse primary osteoblasts (POBs), the activation of the expression of RUNX2 target genes and osteoclastogenesis were confirmed. Also, the stimulatory influences of RUNX2 on RANKL presentation on the membrane of osteoblasts were tested, as a novel mechanism of osteoclastogenesis.
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Asset Metadata
Creator
Xiong, Jian
(author)
Core Title
RUNX2 stimulates osteoblast-driven osteoclastogenesis by RANKL presentation
School
Keck School of Medicine
Degree
Master of Science
Degree Program
Biochemistry and Molecular Biology
Publication Date
08/05/2013
Defense Date
06/17/2013
Publisher
University of Southern California
(original),
University of Southern California. Libraries
(digital)
Tag
mouse primary osteoblasts,OAI-PMH Harvest,osteoclastogenesis,RANKL,RUNX2
Format
application/pdf
(imt)
Language
English
Contributor
Electronically uploaded by the author
(provenance)
Advisor
Tokes, Zoltan A. (
committee chair
), Frenkel, Baruch (
committee member
), Mariani, Francesca (
committee member
)
Creator Email
jianxion@usc.edu,silviaxiong0923@gmail.com
Permanent Link (DOI)
https://doi.org/10.25549/usctheses-c3-316502
Unique identifier
UC11292677
Identifier
etd-XiongJian-1962.pdf (filename),usctheses-c3-316502 (legacy record id)
Legacy Identifier
etd-XiongJian-1962.pdf
Dmrecord
316502
Document Type
Thesis
Format
application/pdf (imt)
Rights
Xiong, Jian
Type
texts
Source
University of Southern California
(contributing entity),
University of Southern California Dissertations and Theses
(collection)
Access Conditions
The author retains rights to his/her dissertation, thesis or other graduate work according to U.S. copyright law. Electronic access is being provided by the USC Libraries in agreement with the a...
Repository Name
University of Southern California Digital Library
Repository Location
USC Digital Library, University of Southern California, University Park Campus MC 2810, 3434 South Grand Avenue, 2nd Floor, Los Angeles, California 90089-2810, USA
Tags
mouse primary osteoblasts
osteoclastogenesis
RANKL
RUNX2